Les techniques modernes d’identification Progrès technologiques : résultats plus rapides, plus précis avec des manipulations réduites. Méthodes traditionnelles : base de la formation. Parfois les seules applicables et servent de référence ou de contrôle. Mais dépense notable de temps, de milieux et de materiel. l. Les méthodes standardisées 1) Intérêt pratique Economie (dépend des conditions d’achat, si grand nombre : prix réduit). org Gain de place (sur pa sse Possibilité d’automati tio 2) Intérêt scientifique Précision Nombre de tests supérieurs (plus grande précision) Identification des biotypes
Utilisation dans les enquêtes épidémiologiques (aide dans détermination de l’origine d’une contamination et contrôle si souche responsable de toute l’infection) Fiabilité Choix judicieux des milieux et des divers substrats Préparation standardisée et mise au point minutieuse des modalités techniques Traitement numérique des résultats avec obtention d’un code Traitement informatique des resultats 3) Principe des méthodes standardisées (galeries d’identification) Microméthodes classiques Premières commercialisées négative (limpide) Ex : API 20 CAUX ( : Candida auxanographiques) 4) Exemples de dispositifs commercialisés
API System API 20E Visualisation des réactions biochimiques, lecture en fonction des couleurs (direct ou indirecte avec ajout de réactifs) 20 réactions : on fait des groupe de 3 et on attribut des valeurs aux 3 réactions 1, 2, 4 On additionne les valeurs des tests positifs et obtient un chiffre compris entre O et 7. On obtient un nombre à 7 chiffres Entérotube Roche 12 compartiments traversés par une aiguille On flambe l’extrémité de l’aiguille puis on prélève une colonie. On inocule les 12 compartiments en un seul geste (en tirant l’aiguille). On sépare les réactions en groupe de 3. On obtient un nombre à 5 chiffres
Test moins complet car uniquement 12 tests mais inoculation rapide. Galeries AES 10 puits Iseul puits peut faire 2 tests différents Système d’innoculation : répartition en bas puis renverse la plaque = ensemencement Règles générales d’emploi Examen microscopique et tests d’orientation préliminaires permettent le choix de la galerie (coloration de Gram, catalase,… ). Coloration de Gram CG+, BG-,BG+ : idée sur morphologie bactérie Test catalase (formation de bulles avec l’eau oxygénée) catalase : API staph CG+ catalase – : API strep BG- catalase + : API 20NE d’antibiogramme sont actuellement automatisables.
Automates d’identification Ils se différencient par Degré d’automatisation (appareil capable de faire inoculation, lecture… ) Durée d’incubation Incubation classique (12 à 18h) Incubation semi-rapide (8h) Incubation rapide (4 à Sh) Gamme des applications possibles Nombre d’analyses effectuées (10 à 50 analyses simultanées) Degré d’informatisation des résultats 1 Vitek (Biomérieux) Le plus utilisé, un des plus fiables.
Utilisation de substrats et d’inhibiteurs 30 puits par carte % d’identification correcte des gram- : 75 à 97% Cartes disponibles ‘ 2-13h Gram- identification 99 espèces 2-15h Gram+ identification 48 espèces -1 Oh Baclllus 17 espèces 4h Anaérobies 120 espèces 24-48h Levures 36 espèces 4-18h Non fermentant identification 5) Phoenix (Becton Dickinson) Système combiné : identification et antibiogramme Plaques en polystyrène de 136 micropuits Visualisation colorimétrique et fluorométrique 6) Microlog ML3 (Biolog, AES Laboratoire) Identification de 2000 espèces microbiennes (bactéries, levures et moisissures) Identification basée sur la respiration en présence de 95 sources de carbone Utilisation de plaques de titration de 96 puts Visualisation de la croissan spiration qui va réduire le pathogènes : absence dans le produit Moins de 1 germe dans 25g de produit pour germes hautement pathogènes (salmonella, listeria). Autres germes, le risque est fonction de leur importance numérique : dénombrements inférieurs à certains seuils seront tolérés Moins de 103 coliformes par g Techniques spécifiques pouvant fournir des résultats quantitatifs positifs Méthodes rapides et de moindre cout 1 Critères idéaux des techniques en bactériologie alimentaire : Haute spécificité Haute sensibilité Quantification des résultats Bref délai de réalisation Automatisation Faible cout Idéalisation, aujourd’hui rien ne répond à tous les critères. Les premières méthodes Dénombrement sur milieux gélosés puis identification Utilisation de milieux sélectifs, de milieu chromogéniques Techniques les plus fiables et considérées comme méthodes de référence Toutes nouvelles méthodes font être comparées à ces méthodes de référence : coefficient de corrélation R doit être proche de 1 Problème : manipulation longues, laborieuses, pouvant nécessiter des étapes d’enrichissement (salmonelle, listeria) Les milieux chromogènes Reposent sur les mêmes principes que les milieux traditionnels avec, en plus, la mise en évidence de réactions enzymatiques actériennes par l’hydrolyse de substrats spécifiques, les substrats chromogènes. Premier brevet est déposé Alain Rambach . ilieu boites de milieu de culture Reconnaissance normative et réglementaire Inconvénients : Contrainte de l’activité enzymatique prix plus élevé Identification possible de la bactérie ou de la levure (étape vers identification, mais doit faire d’autres tests Détection et dénombrement des MO (compte les colonies en fonction de leur couleur) Milieu Baird-parker Isolement de S. aureus (colonies noires, convexes, entourée d’un halo clair de 2 à 5mm de diamètre) Peptone trypsique de caséine log Extrait de viande Sg Extrait de levure 2g Pyruvate de sodium IOg= accélérateur de croissance Glycocolle 12g = accélérateur de croissance Chlore de lithium 5g Agar 14g Tellurite de potassium à 1% lml = agent sélectif et indicateur de réduction (couleur noire) Emulsion de jaune d’œuf à 5ml = élément nutritif et révélateur enzymatique (a l’origine halo) Sulfaméthrazine à 0. 2% 2. 5ml= inhibiteur de Proteus Milieu BCP (pH 6. ) Extrait de viande de bœuf, bio polytone Milieu gélosé ordinaire Lactose : source de carbone et d’énergie Indicateur de pH : bromocrésal our re Milieu basique : violet = M e lactose résultat Sélectivité : 1 supplément sélectif spécial pour l’eau Performance : parfaite corrélation avec la norme b) Réaction antigène-anticorps Détection directe d’une bactérie dans un mélange complexe Ac polyclonaux ou monoclonaux (ACM) dirigés contre les Ag de surface des bactéries Préférence des Ac monoclonaux : affinité + importante, stabilité dans la production Détection de la réaction Ag-Ac par : Observation d’un précipité en milieu gélosé (immunodiffusion, électrosynèrèse) ->sensibilité faible Agglutination de particules sensibilisées (microbilles de latex, lobules rouges, bactéries dont la paroi est riche en protéine A qui fixent les lgG par leur partie FC) -> en présence de l’Ag correspondant on a une agglutination visible à l’oeuil nu.
Couplage des Ac à des molécules servant de marqueur -> augmentation de la sensibilité Radioisotopes (sensibilité maximum, contraignants) Molécules fluorescentes (isothyocyanate de fluoresceine, rhodamine) Enzymes (péroxydase, n-galactosidase) : sensibilité, souplesse, automatisation possible ELISA Exemples : ELISA permettant de détecter les Listeria, Salmonella salmonella Agglutination (Ac polyclonaux spécifiques de LPS) : détection 108 actéries/ml Immunofluorescence indirecte (Ac polyclonaux spécifiques de LPS) : détection 105 à 106 bactéries/ml mais présence de réactions faussement positives ACM lgA dirigé contre un Ag flagellaire commun à de nombreuses Salmonella -> détection dans des cultures mixtes ou des échantillons d’aliment éries atteindre le seuil de détection.
Détection de toxines synthétisées par les bactéries et pouvant être responsable de TIA (toxl Infection alimentaire) Soit production de toxines dans les aliments (toxines botuliques, entérotoxines de staphylocoques). Soit synthèse dans le tube digestif (entérotoxines de Clostridium erfringens : BG+, ANAs, capable de sporuler). Ex : tests pour détecter les entérotoxines de staphylocoques Immunodiffusion (sensibilité : 100 ng/ml) Radio-immunologie et ELISA avec ACM ou Ac polyclonaux (sensibilité : Ing/ml) c) Techniques d’hybridation nucléique Spécificité : complémentarité de 2chaines d’ADN ou d’ARN Principe : hybridation d’une sonde (segment AN connu) avec une cible d’une bactérie à identifier Sonde .
Fragment d’ADN chromosomique, d’ADN cloné ou un oligonucléotide de synthèse Correspond à un gène ou une partie de gène particulier (gène de irulence codant pour une toxine, caractère d’antibiorésistance. „) Les sondes longueus sont plus spécifiques et plus sensibles que les sondes courtes Le degré de spécificité est aussi fonction des conditions d’hybridation, de lavages. Pour la détermination de l’espèce bactérienne -> sondes ADN dirigées contre les ARNr (en particulier ARN 16S) Les ARNr sont présents à plus de 100 000 copies par bactérie ->bonne senslbillté de la méthode ->très conservés au sein d’une même espèce Révélation des hybrides sondes-acide nucléique cible s’effectue par un marqueur incorporé dans la structure de la sonde
Radioisotopes enzymes) -> amplification de la réaction Système avec radio-isotopes sondes « chaudes » plus sensibles que les sondes « froides » (20 à 50 fois plus) Avantages des sondes « froides » : stabilité et utillsation dans les laboratoires non spécialisés Une des techniques les plus employées : hybridation sur filtre Immobilisation de l’ADN cible sur une membrane (nylon, cellulose) Puis hybridation avec sonde Existe plusieurs voies de préparation de l’ADN cible : purification d’ADN d’une souche bactérienne identification bactériologique Extraction d’ADN directement de colonies bactériennes hybridation sur colonies) identification et numération Extraction et purification d’ADN d’un echantillon biologique -> identification directe de certaines bactéries dans le prélèvement Sensibilité des techniques : 105 à 106 bactéries/ml ->nécessite une étape d’enrichissement Ex : gene Track system Etape d’enrichissement de 48h Etape d’hybridation de 4h Résultats faussement négatifs : 10% pour le kit listeria. d) Gene track système 1. Enrichissement par culture (48h) 2. Gene track système a.
Lyse de l’échantillon Ajout de la solution de lyse dans le tube et incubation pour libérer l’ARNr. b. Hybridation Aout de la solution de son PAGFac. Fq ion. Les sondes ADN contenant l’enzyme conjugué et incube. Ex : Enzyme = peroxydase 5. Développement de la couleur Lave les dipsticks et les place dans des tubes contenant les substrat chromogène Incube pour le developpement de la couleur. Élimine les dipsticks. Ajoute la solution stop aux tubes. 6. Détection Lire absorbance à 450nm à l’aide du spectrophotomètre Gene- Track Hybridation entre sonde et ARN cible gène recherché se trouve bien dans échantillon Inconvenient : prix élevé (100€) mais intéressant. ) Technique PCR = technique d’amplification de gènes. Amorces : 2 amorces Longueur 20 nucléotides Choix des amorces détermine le niveau de spécificité ADN polymérase (Taq) • Thermostable, t 0 opt = 720C Extraite de Thermus aquaticus (bactérie thermophile) Pas fidèle : 1 erreur toutes les 2500 bases Cycle : Dénaturation à 950C, 1 à 2 min Hybridation des amorces à 50-550C, 1 à 2 min Extension des amorces à 720 C, 2 à 3 min Au bout de 30cycles taux d’amplification théorique de 109 Détection du fragment amplifié • visualisation directe après électrophorèse en gel d’agarose et par hybridation avec une sonde d’ acide nucléique Sensibilité : *AGF g c,Fq
