Autour de la caséine : préparation des caséines, détermination de sa concentration, analyse d’acides aminés constitutifs Madison Trinquart madison. tnnquart@etu. univ-amu. fr Courprie-Bompart Justine justine. courprie-bompart@etu. univ -amu. fr p g Résumé : Le lait est composé de protéines appelé caséine. Lors de ce TP, nous nous sommes familiarisé avec des techniques classiques de biochimie en utilisant la caséine comme protéine d’étude.
Introduction : La caséine est une protéine constituant la majeur partie des composants azotés du lait. Pour travailler sur les caséines nous evons les isolées des autres constituants grâce à la précipitation isoélectrique ou point isoélectrique (pHi) où est un pH particulier ou la protéine contient autant de charges positives que de charges négatives. Ensuite, nous avons quantifier la tyrosine (Tyr, Y), qui est un acide aminé aromatiques, polaire et donc hydrophobe.
On la quantifie donc dans une préparation pour déterminer la concentration en caséines à partir de la quantité du lait à 4,6 qui est le pHi moyen des caséines, à ce pH les caséines vont précipiter, ensuite il faut récolter le précipité par entrifugation et le laver à l’éthanol pour éliminer les molécules d’eau et le faire sécher. 20 mL de lait écrémé a été mesuré avec une éprouvette et verser dans un bécher. 5 mL d’acide acétique ( mol/L) on été ajouté puis laisser reposer sur la paillasse 5 min. e mélange a été centrifugé 10 min à 100C à 4000tr/min dans un tube falcon. Le surnageant a été éliminé. Le tube a été laissé sur la paillasse afin qu’il s’égoutte. 10 ml- d’éthanol ont été ajoutés et le précipité a été remis en suspension. Le tube a été centrifugé à 4 min à 4000tr/min. Le surnageant a ?té jeté et l’eau éliminé. 10 mC d’éthanol 95%, le précipité a été rems en suspension puis a été centrifugé 5 mn à 4000tr/min. Le surnageant a été jeté et le reste mis a égoutté.
Le précipité a été récupérer sur un morceau d’aluminium et laisser sécher jusqu’au lendemain sur la paillasse. Le culot a été pesé après séchage et le rendement de notre préparation en comparant à la composition du lait donnée sur les bouteilles commerciales a été calculé. Détermination de la concentration en caséines dans une solution pour déterminer la concentration en protéine dune solution on eut doser la quantité d’un acide aminé constitutif, la tyrosine libre en est un facile à doser.
Le nombre de tyrosine libre dans l’échantillon de caséine permet de connaitre la concentration en caséine de cette solution. 2 libre dans l’échantillon de caséine permet de connaitre la concentration en caséine de cette solution. Le travail est fait ? partir d’une solution de caséines purifiées et hydrolysées. Pour le dosage des tyrosines on utilise le réactif de Folin-Ciocalteu. En effet, en milieu alcalin, ce réactif est réduit par le noyau phénolique des résidus de tyrosine libres. Cette réaction donne une coloration bleue permettant un dosage colorimétrique.
On peut étalonner la coloration grâce à une solution de tyrosine pure. 2 solutions ont été utilisé, une solution de tyrosine à 50 mg/L dans HCL 0,2 mol/l_ et un hydrolysat de caséines solubilisé dans HCL 0,2 mol/L. Une gamme de concentration allant de O ? 50 mg/L dans un volume final de 1 ml_ a été réalisé. Les solutions de tyrosine et d’HCL 0,2 mol/L ont été pipetés avec un Pipetman (Pl 000). Dans un nouveau tube, 500pL de chacune des solutions préparée (6 tubes pour la gamme étalon et 3 tubes pour le osage de la solution diluée de caséines) ont été pipetés. ,5 mL de NaOH mol/L et 0,25 mL de réactif de Folin ont été ajoutés dans chaque tube. Nous avons lu les absorbances à 750 nm contre le témoin (T) après 5 à 10 minutes d’attente. Les valeurs ont été notées. La courbe d’étalonnage en reportant les valeurs d’absorbances en fonction de la concentration en tyrosine pure a été tracée. Les valeurs d’absorbance des échantillons dhydrolysat dilué de caséines ont été reportées sur cette courbe. A partir de cette concentration massique de la tyrosine, 3 ?té reportées sur cette courbe.
A partir de cette concentration massique de la tyrosine, sa concentration molaire a pu être déduite. La concentration molaire de caséines également été déduite. Les caséines ont été préparées à partir d’I de lait. Les culot sec obtenu a été dissout dans 3L d’HCL 0,2M. A partir des résultats de concentration massique, le rendement de la précipitation de caséines a été calculé. Séparation, par chromatographie de partage, des acides amnés provenant dihydrolysat de caséines : Des tri-peptides provenant de la solution de caséines hydrolysée nt été isolés et l’hydrolyse poursuivie.
Cette technique permet de connaître la composition en acides amnés de petits peptides provenant d’hydrolyse. Dans la chromatographie sur couche mince, il y a une phase stationnaire qui correspond au support polaire, qui est constitué de cellulose fixée sur un film plastique appelé la couche mince. Une autre phase, la phase mobile, correspond à un solvant apolaire qui migre le long de la phase stationnaire par capillarité (phénomène d’interaction qui se produit aux interfaces entre deux liquides non miscibles).
Plus les substances du mélange sont solubles dans la phase mobile plus elles migreront sur le support et inversement pour les substances qui sont solubles dans la phase stationnaire. La solubilité des acides aminés dans les deux phases dépend de la structure chimique de leur chaine latérale. Les atomes O ou N sont déterminant pour les caractères hydrophiles et hydrop 4 leur chaine latérale. Les atomes O ou N sont déterminant pour les caractères hydrophiles et hydrophobes. Cette chromatographie est réalisée dans une cuve de verre close. Afin de comparer les igration on définit le Rf.
Une feuille de cellulose a été utilisée. Une ligne de dépôt à 2 cm du bord du film ainsi qu’un repère tout les cm ont été tracés. Chaque acide aminé connu (14) et 2 fois chaque hydrolysat de tripeptide ont été déposés. 0,2pL à 0,5L sont donc déposés avec des capillaires. Le film a été posé dans une encoche de la cuve. Le chromatogramme a été retiré de la cuve quand la phase mobile a atteint les 3/4 du film. Une solution de ninhydrine à 0,2 % dans le mélange éthanol-acide acétique a été pulvérisé afin de visualisé les acides aminés.
Résultats : Premier manipulateur : Deuxieme manipulateur : S Met et Lys ; Pro, Asn, et Glu ; IIe, Glu et His. Discussion : Une différence de rendement en caséine est constatée entre les deux manipulateurs. Le rendement du deuxième manipulateur est trop élevé. Ceci pourrait s’expliquer par la présence d’eau lors de la peser de la caséine, le retour en suspension du précipité ou tout simplement une mauvaise manipulation. Une légère différence est observée entre les deux courbes d’étalonnages. Cela peut s’expliquer par une différence entre les absorbances mesurées.
La compositon des tripeptides sont différentes chez les deux manipulateurs, ce qui est normal étant donner qu’ils ont tout les deux utilisés des acides aminés différents. Conclusion . Trois types d’expériences on ainsi été étudiés et réalisés. De mauvaise manipulation ont conduites à de mauvais résultats. Les résultats des expériences ne sont pas convainquant, l’on aurait pu utilisé un lait avec moins de matières grasses afin d’avoir plus de protéines. Abréviations : -Gly : Glycine -Met : Méthionine -Asn : Asparagine -Val : Valine -Trp : Tryptophane
