Identification des séquences codantes entières des sous-unités de récepteurs nicotiniques chez le puceron du pois Acrythosiphon pisum. Jérémy GATINE Pesticides are used widel , for professional usage li 7 p g crops or in casual life in _ health public proble « Plan-Santé Environ control and limit the use of the most toxic pesticides.
Among them, insecticides, which act on the central nervous system, are largely incriminated, and particularly Néonicotinoids, which are responsible of insect’s death by neuronal toxicity. They target specifically insect nicotinic acetylcholine erged in order to assive de pesticides à usage agricole ou domestique est aujourd’hui devenue un problème de santé publique, comme en témoignent les plans Santé- Envrionnement et Santé-Cancer lancés par l’INSERM ces quatre dernières années.
Des études ont montré que les pesticides agissent comme des boosters tumoraux, entrainant notamment une augmentation de l’angiogenèse (1 Des initiatives nationales et européennes ont été lancées pour prévenir, et réduire d’une manière générale, l’utilisation de ces agents phytopharmaceutiques permettant ainsi la limitation des espèces végétales invasives, des bio-agresseurs et/ou des arasites néfastes pour rhomme.
Ainsi le Plan Ecophyto 2018 issu du Grenelle de l’Environnement vise à réduire de moitié l’utilisation des pesticides, le programme européen REACH ayant comme objectif quant à lui l’évaluation et l’élimination des molécules les plus dangereuses depuis juin 2007. Cependant, un effort de recherche est nécessaire pour définir de nouvelles méthodes ou de nouvelles molécules peu toxiques pour Vhomme. Parmi les pesticides, la classe des insecticides particulièrement incriminée, du fait de leur action majoritaire au niveau du système nerveux central (SNC).
Ainsi des insecticides ont neurotoxiques et pe NéonicotlnoÎdes, qui sont des molécules de synthèse dont la structure chimique est dérivée de la nicotine, ciblent les récepteurs ? acétylcholine nicotinique (nAChRs) chez les insectes. Cette catégorie produits phytopharmaceutiques majoritairement utilisés dans la protection des grandes cultures et en arboriculture représente environ 25% du marché mondial des insecticides et l’expiration des brevets ces dernières années ne vont qu’accentuer leur utilisation mondiale (2).
Ainsi, les populations professionnelles utilisant ces insecticides et les populations mitoyennes es zones d’utilisation sont soumises ? une intoxication chronique par ces composés. En effet, bien que ces molécules soient sélectives des insectes, les récepteurs cholinergiques nicotiniques sont également présents dans le système nerveux humain (3). récepteurs nicotiniques (nAChRs) sont responsables de la transmission de l’influx ne relocalisation du récepteur, une modification des propriétés fonctionnelles et biophysiques, ou une variabilité des propriétés pharmacologiques (4).
Chez la souris, la diversité des nAChRs a été bien identifiée (5) reflétant un panel de sous-unités plus important. La localisation des sous-unités dans le SNC est extrêmement variable et conditionne leur association (6). Bien que les homologies de séquences des sousunités soient faibles entre Insectes et Mammifères, la structure tridimensionnelle des récepteurs humains est proche de celle des insectes. Ceci pourrait en partie expliquer les effets délétères de ces produits sur la santé humaine, notamment fonctions cognitives.
Cenjeu de la recherche actuelle est dorénavant de concevoir un modèle permettant l’analyse simultanée de nouveaux agents pharmacologiques sur les récepteurs nicotiniques natifs de deux rganismes différents, en l’occurrence d’homme ou de mammifère et d’insecte, dans un même système. Avant 2012, seuls des modèles de récepteurs nicotiniques chimères étaient disponibles pour les étude 4 OF nouvelles molécules entre les récepteurs recombinants d’insectes et de mammifères..
Matériels & Méthodes Matériel biologique Des femelles adultes parthénogénétiques du puceron du pois Acyrthosiphon pisum (souche LSRI dont le génome est séquencé et annoté : IAGC, Plos Biol 2014) sont élevées à 220C sur leur plante hôte (féveroles, Vicia fabae) sous une photopériode 16L :8D. Les ARN totaux ont été extraits puis soumis à une transcription inverse à l’aide des kits RNeasy Mini Plant@ (Qiagen, Courtaboeuf, France) et RevertAid (Thermoscientific, Waltham, USA), respectivement.
Les ADNc ont ensuite été stockés à -200C. Afin d’éviter des contaminations d’ADNg les ARN totaux avaient préalablement subi un traitement à la DNAse I (Invitrogen, Ca Isbad, USA). Amplification des séquences codantes de sous-unités de récepteurs nicotiniques. Les séquences codantes des sous-unités Dl, [12, [13, D4, [17 et ont été recherchées à l’aide d’amorces conçues ? artir des transcrits des sous-unités identifiées dans le génôme (Tableau 1).
Trois types d’amplification ont été utilisés : *PCR classique impliquant soit une Taq conventionnelle qui produit des amplicons extrémités l,’ d’optimiser la température d’hybridation d’un couple d’amorces données. Ce protocole implique un thermocycleur dont la température de chaque colonne peut être réglée sur une température souhaitée allant de façon croissante sur une même ligne (thermocycleur Techne@ TG5000) et permettant une amplification des matrices des températures d’hybridation variables.
PCR emboitée (ou PCR nichée) nécessitant deux PCRs consécutives, le produit d’amplification de la première devenant la matrice de la seconde.. La première amplification utilise un couple d’amorces situées dans les parties non traduites des transcrits (UnTranslated Regions : UTRs), la seconde impliquant des amorces situées en aval (extrémités 5′) ou en amont (extrémités 3′) des amorces précédentes. Les produits d’amplification sont visualisés par électrophorèse sur gel d’agarose 1 % (Sigma) préparé dans du tampon TAE (solution 50X : 40mM Tris ; 20mM acide acétique ; lmM EDTA) (Thermo
Scientific).. La migration a lieu durant 25 min à 100V dans un tampon Tris-AcétateEDTA en présence d’un marqueur de taille 6 OF dans l’eau pure. La concentration des ADN est mesurée par specrophotométrie (NanoDrop@, Wilmington, USA). Lorsque la qualité du produit de purification est satisfaisante, les ADNc sont soums au séquençage (GATC Biotehc, Mulhouse, France) ou insérés dans un vecteur de clonage pour amplification. Clonage Les vecteurs pCR4TOPO (Invitrogen, Carlsbad, USA) pJet1. (ThermoScientific, Waltham, USA) ont été utilisés afin d’insérer des amplicons disposant d’extrémités cohésives ou ‘extrémités franches, respectivement. Environ 100ng d’ADN purifié est inséré vecteur selon recommandations du fournisseur, lors d’une incubation de IOmin à température ambiante. Un aliquot de 50pL de bactéries chimocompétentes (One Shot Max Efficiencv DH5-O Tl ; Invitr 5mL de LB+ampicilline) en vue de l’extraction plasmidique.
La PCR sur colonies est réalisée dans un volume total de 10gL en présence de GoTaq@ (Promega, Fitchburg, Wisconsin, U SA) et d’amorces universelles M13F&R (vecteur PCR4TOPO) ou d’amorces pJet1. 2F (vecteur pJet1. 2) selon les recommandations du fournisseur. Les olonies présentant une bande à la taille attendue lors de l’électrophorèse sont sélectionnées pour l’extraction plasmidique en vue du séquençage. Cextraction plasmidique est réalisé avec le kit Nucleospin plasmid@ (MachereyNagel, Hoerd, France) ? partir des cultures de 5mL validées par la PCR sur colonies, recommandations du fournisseur.
La concentration et l’intégrité ADN sont vérifiées spectrophotométrie (NanoDrop@, Wilmington, USA) puis préparés pour le séquençage (GATC Biotech, Mulhouse, France). Chaque échantillon d’ADN a été séquencé à partir de chac DreamTaq et de la GoTaq (Figure 1 B, Tableau 2) en conditions de PCR classique et de PCR nichée. Néanmoins, les clonages de ces bandes purifiées dans les deux types de vecteurs n’ont pas permis d’obtenir des clones positifs. Le séquençage du produit de PCR purifié a été envisagé mais n’a donné aucun résultat.
Sous-unités Cl 1, 02, [14, C18 Les séquences codantes entières des sous-unités M, 02, 03 et 08 ont été recherchées à l’aide des deux types de Taq et des trois types de PCR (classique, nichée et gradient). Les amplifications ont conduit à des amplicons de taille inférieure à la taille attendue, exceptée la sous-unité Figure 2) pour laquelle un amplicon d’environ 1650 pb compatible avec la taille théorique de 1 624 pb envisagé avec les amorces utilisées. Malheureusement, le séquençage de ces amplicons purifiés n’a donné aucun résultat. ous-unité 03 La recherche de la séquence codante entière de la sous-unité [13 a été réalisée par amplification par PCR classique via les deux types de Taq. Dans les deux cas, le profil obtenu montre trois tailles d’amplicons dont deux sont inférieures ? 1000pb et une troisième se situe entre 1650 et 200006, ce qui est taille aberrante, le produit de PCR purifié tilisé pour le clonage a également été préparé pour séquençage. Seules les séquences obtenues à partir du produit de PCR purifié ont été exploitables.
L’analyse des similitudes a montré une homologie de séquence avec les sous-unités 03 de plusieurs espèces d’insectes (Tableau 3). Le transcrit théorique de la sous-unité 03 qui avait été reconstruit à partir des informations génômiques a été utilisé pour positionner les séquences obtenues. L’alignement de ces séquences de 178pb (extrémité 5′) et 314pb (extrémité 3′) a été réalisé à l’aide du programme ClustalW 11) via le programme BioEdit (Figure4).
Discussion Au regard des manipulations effectuées et des résultats obtenus lors de cette étude, plusieurs points peuvent être abordés. Parmi les six sous-unités ciblées, trois sous-unités ont montré des amplifications compatibles avec les tailles théoriques des amplicons et une seule a permis d’obtenir séquences exploitables. Les défauts de clonage n’ont pas pu être résolus bien que les ADN purifiés étaient de bonne qualité et que le ratio insert/vecteur ait été testé à plusieurs reprises. L’utilisation d’un mix de Ta dont une haute fidélité pourrai 0 7
