Université de la Réunion Département de Biochimie et Biologie Moléculaire UES34BC22 Enzymologie et Bioénergétique Année Universitaire 2014 – 2015 Enseignant responsable : Christine Robert-Da Silva Sni* to View ENZYM Exercice 1 d’équilibre K’eq or 21 Soit 5 réactions de type Calculer les proportions de sachant que les variations de ces 5 constante A et B à l’équilibre, d’enthalpie libre standard réactions sont respectivement de 0/115/10 et 20 kJ. mol . on donne R 8. 315 J. mol .
OK Déterminer H202 sachant que de transition non le la facteur d’accélération de H20 + h 02 éaction variation d’enthalpie libre de l’état est de 18,7 kcal. mol pour la réaction catalysée et de 2 kcal. mol lorsque la réaction est effectuée en présence de catalase. Exercice 5 catalysée 14 Facteur d’accélération d’une réactlon 8. 0 et à 200C, l’enzyme uréase A pH augmente la vitesse d’hydrolyse de l’urée d’un facteur 10 . Si une quantité donnée d’enzyme peut hydrolyser complètement une certaine quantité d’urée en 5 minutes, combien de temps faudra. —il (en mllieu stérile, afin d’exclure une attaque bactérienne de l’urée), pour que la même uantité d’urée soit hydrolysée en l’absence d’uréase Enzymologie Détermination de KM et Vmax Exercice On étudie galactosidase en fonction temps. Afin étude cinétique de la –galactosidase l’hydrolyse du lactose par la p— l’apparition en mesurant du d’étudier 91 du glucose concentration f(1/[S]) et en Exercice 2 déduire graphiquement KM et Une étude cinétique d’une peptidase intestinale Vmax. st effectuée en présence de glycylglycine, substrat. Écrire l’équation de la réaction Les résultats de l’expérience sont dans le tableau ci—dessous Vitesse de Produit formé (pmol. _ *min ) 0,21 2 0,24 0,28 4 0,33 8 16 0,45 Déterminer graphiquement KM et Vmax. Exercice 3: son donnés L’étude d’une réaction enzymatique a donné résu tats suivants 3 1 les Quelle est la valeur de Ki? La inhibiteur utilisée est de 1 mM. Exercice 3 en La phosphatase alcaline catalyse l’hydrolyse des esters phosphoriques en milieu basique.
On étudie Factivité de cette enzyme pour l’hydrolyse du paranitrophénylphosphate (PNPP) en absence ou en présence de phosphate pNpp ! + A partir du tableau ci—dessous, déterminer le type d’inhibltlon provoqué par le phosphate et calculer la Pouvait—on prévoir ce résultat constante d’inhibition. a V priori ? (pmol. L . min ) [pNpp] mmol. l_ Sans inhibiteur [Pl* I mm 01. 1_ 1,78 2,18 1,70 2,46 mmol. L 1 inhibitions de la carboxypeptidase pour ces Calculer la constante d’inhibition inhibiteur. Influence du pH. La carboxypeptidase hydrolyse un deux composés.
Ki de chaque dipeptide (Ala—Tyr) en deux acides aminés Ala, Tyr Le tableau suivant donne la vitesse initiale d’hydrolyse en fonction de la concentration de substrat à divers pH. Tracer les courbes Vmax f(pH). f(pH) et KM 4,5 10 0,02 0,18 1,82 0,07 0,67 6,67 0,95 Commenter les résu tats obtenus. mmol / I PAGF s 1 cinétique de l’invertase. L’invertase catalyse la réaction d’hydrolyse du eau +saccharose » glucose + fructose. saccharose Influence de la concentration en enzyme on réalise une série d’expériences pour des concentrations croissantes en enzyme.
Les autres conditions opératoires température 250C, pH, concentrations initiales en substrat sont les essai est réalisé mêmes pour chaque essai. en introduisant dans un ml_ de solution d’enzyme de molaire CE mol. L 1 ml_ de solution tampon 1 mC de solution de substrat On dose le glucose apparu à intervalles Chaque tube temps réguliers. Les résultats obtenus sont reportés suivant CE mol. L 1. 10 p (pmol 1,5 2,5 dans le tableau glucose apparu par tube) PAGF 1 250 C.
Sachant que la masse l’enzyme est égale à 250000 l’activité spécifique de l’enzyme. molaire de g. mol , calculer e) On réalise un essai à partir d’un extrait cellulaire renfermant li enzyme. Cet extrait contient 300 mg de protéines pour 100 mC Sachant que dans les mêmes conditions que précédemment il apparait 3,6 pm al glucose en pure de 4 min de réaction l’activité de 1 mL de cet extrait la concentration molaire en enzyme et extrait en déduire le pourcentage en masse d’enzyme pure dans les protéines de l’extrait.
Influence de la concentration en substrat on réalise une nouvelle série d’expériences pour concentrations croissantes de substrat, les autres conditions opératoires étant identiques pour tous les essais. Chaque essai est réalisé de la manière suivante 1 ml_ de identique 1 mC de 1 mL de On dose consignes [S] mol. L solution d’ enzyme de pour tous les essais solution tampon solution de substrat résultats le glucose apparu, les dans le tableau suivant PAGF 7 1 (45 min) La pancréatine est n extrait poudre, contient toutes pancréatiques. On se propose pancréatique en les enzymes d’étudier l’activité une enzyme qui de la ipase.
La lipase hydrolyse triglycérides en leurs selon la réaction suivante Triacylglycéro On prépare Remarque Essai A Essai g + 3 H20 ! 2 essais de Le tampon acides gras constitutifs 3 acides gras + glycérol la façon suivante Tris permet d’ajuster le pH à la valeur Solution de sels 3 ml_ initiale choisie 9,2 qui mais ce pH optimum d’activité biliaires Emulsion d’huile 40 40 mL lipase, tampon est à une concentration trop d’olive ensuite le pH constant our maintenir Eau distillée faible 39 pendant Tampon 16 mL le déroulement de la tris réaction.
NaOH versés en mC Temps (min) Essai B 0,10 0,20 0,30 0,60 0,50 1,00 0,80 1,60 1,88 12 1,20 2,02 2,15 | 0) Expliquer pour quelles raisons il y a nécessité de verser la solution d’hydroxyde de maintenir le pH constant. sur un même graphique 20) Tracer Vsol NaOH versé f tem s _ 30) Définir la vitesse ction PAGF 91 sodium pour les 2 courbes et établir la 50 0,04 0,06 0,08 0,12 concentrajon substrat (mol. L—1) – Nommez cette courbe. Commentez cette courbe. 2 – Ecrire l’équation de cette courbe. – Définir Vmax et KM.
Dans les conditlons de cette expérience, donnez l’unité de chacune de ces 2 grandeurs. 4 – L’expérimentateur peut-il sur cette courbe obtenir les valeurs de Vmax et KM ? Si oui donnez les valeurs de Vmax et KM. Si non expliquez ce qu’il faudrait faire pour y arriver. Question subsidiaire C – L’expérimentateur souhaite étudier l’impact de la température sur les paramètres de l’enzyme. Son étude montre que seule la vitesse est modifiée en fonction de la température. Donner fallure de la courbe. Expliquez le phénomène qui permet d’expliquer cette courbe.
