GIRAUD Tanguy LB Chimie NICOLAS Marion 2014/2015 PEREIRA Jérémy CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE I Introduction : Au cours de ce TP no l’identification d’un m en phase liquide. La chromatographie composés en fonctio or 12 Sni* to View ation et ar chromatographie ue de séparation de inité avec dautres molécules. Il existe de nombreux types de chromatographies mais celle qui nous intéresse aujourd’hui est la chromatographie de partage ou liquide-liquide.
Le but de cette manipulation est de séparer les différents composants d’un mélange résultant du partage des solutés entre deux phases : l’une dite « stationnaire » ui est contenue dans la colonne et l’autre dite « mobile » Dans notre cas la phase stationnaire est totalement apolaire, la chromatographie réalisée est dite à po arité de phase inversée et la phase mobile choisie est donc très polaire.
Dans cette méthode, le constituant le plus polaire (parmi tous les solutés qui sont peu polaire) est élué le premier car c’est celui qui présente le moins d’affinité pour la phase stationnaire. Cest sur cette différence de polarité croissante que sont basées nos manipulations. Nous allons déterminer et optimiser les es paramètres de composition de la phase mobile ainsi que son débit afin d’avoir une séparation des composants qui soit la plus performante. Pour cela nous allons faire varier la composition de la phase mobile et effectuer une analyse à chaque modification.
Ensuite nous calculerons les paramètres d’efficacité, de rétention, qui nous permettrons de déterminer les paramètres optimums. Le but final de ce TP est d’obtenir la formule brute d’un alkylbenzène inconnu. Après avoir déterminé les conditions optimales d’analyse en réalisant la séparation d’un mélange constitué de quatre alkylbenzènes. Nous réaliserons la séparation chromatographique de l’alkylbenzène à déterminer ceci nous permettra de déterminer son temps de rétention et calculer son facteur de capacité.
Nous pourrons donc tracer à partir de nos résultats expérimentaux la droite log k’=f(n) dont n est le nombre de carbone de la chaine alkyle. Grâce à nos manipulations la valeur du facteur de capacité sera connue et nous n’aurons plus qu’à résoudre l’équation de droite obtenue pour déterminer la structure du composé inconnu. Il Appareillage : L’appareillage est organisé de la manière suivante : 12 iminuant le temps d’analyse et les temps de rétention des composés à séparer.
Le mélangeur va lui servir à ajuster la composition de la phase mobile. Il joue un rôle important car la qualité de nos manipulations est fondée en grande partie sur le choix de composition de la phase mobile. L’échantillon à analyser est ensuite injecté à l’aide de l’injecteur. Dans le cas de I’HPLC, nous allons utiliser une vanne d’injection avec une boucle d’échantillonnage. Les composés sont donc ensuite séparés dans la colonne puis un détecteur UV va nous permettre d’obtenir un graphe.
Les onnées ainsi obtenues sont ensuite recueillies sur un logiciel d’acquisition Ill Manipulation : A Spectrophotométrie UV Avant de débuter nos manipulations nous allons tout d’abord réaliser l’étalonnage du spectrophotomètre afin d’être certain de l’exactitude de nos mesures. L’objectif est de déterminer l’absorbance d’une solution de bichromate de potassium dans de l’acide sulfurique à différentes longueur d’ondes. Nous pourrons ainsi vérifier l’exactitude de l’appareillage grâce aux données théoriques qui nous ont été données.
L’expérience nous a conduits aux résultats suivants : Longueur d’onde théorique (nm) Longueur d’onde mesurée Absorbance théorique A (IJA) Absorbance mesurée 235 +/-1 242. 3 0,81 19 devons maintenant analyser différents mélanges : le premier est constitué de toluène en solution dans du méthanol Le second est mélange d’alkylbenzènes en solution dans du Avant de démarrer ranalyse spectrophotométrique il est important de fixer les bornes des spectres. Nous travaillons en LIV donc nous nous intéressons qu’aux composés sortant entre 200 et 700nm.
Nous devons ensuite faire un choix sur le type de cuve à utiliser. Nous avons deux possibilités pour le type e cuve à utiliser, une cuve en quartz ou en polystyrène. Etant donné la nature des composés à analyser (dérivés aromatiques) il est préférable d’utillser une cuve en quartz. Le polystyrène est évincé à cause de sa composition chimique. Il s’agit d’un polymère vinylique. Structurellement, c’est une longue chaîne hydrocarbonée, avec un groupe phényle attaché sur certains atomes de carbone.
Il y aura donc des interférences avec ce que nous nous apprêtons à analyser. De plus le quartz n’absorbe pas en UV ça fait donc de lui un bon support pour réaliser pour ‘analyse spectrale. Structure du polystyrène : Spectre d’absorption du toluène pu On constate que l’on aura un maximum d’absorption pour nm. Cela correspond au cycle aromatique du composé. Spectre d’absorption du mélange alkylbenzène/méthanol Le spectre obtenu est semblable à celui du toluène on obtient aussi un Àmax de 261 n étant quasiment PAGF 12 nous permet tout de même les détecter aisément.
B) HPLC: 1) Influence de la composition de la phase mobile et de la température sur la rétention des composés Avant de démarrer notre TP nous avons dû préparer les solutions ‘alkylbenzène ainsi que le mélange comprenant les 4 dérivés que nous analyserons par la suite. Le mélange d’alkylbenzène inconnu a été préalablement préparé par notre enseignant. Pour réaliser la mise en solution du toluène, Etjylbenzène, Propylbenzène et du Butylbenzène nous avons prélevé un volume de 10 pl de chacun d’eux grâce à une micropipette.
Certaines précautions sont à prendre durant la manipulation. Il est impératif de porter des gants et des lunettes durant la réalisation des solutions. De plus tout prélèvement est à effectuer sous la hotte aspirante ? cause des vapeurs aromatiques qui peuvent être nocives. Chaque contenant, bécher, fiole jaugée doit être rincé avec un solvant approprié, dans notre cas il s’agit du méthanol. Lorsque l’on prélève les alkylbenzènes les embouts utilisés pour la micropipette ne doivent pas être manipulés avec les mains pour éviter toute contamination.
Une fois prélevé chaque composé est inséré dans une fiole jaugée de 100ml que fon complètera avec du méthanol jusqu’au trait de jauge. L’analyse en HPLC ne peut pas s’effectuer sans avoir au préalable définit des conditions optimales de mesures pour l’analyse es alkylbenzènes. Avant de pouvoir réaliser l’expérience ? proprement parler, il est important de déterminer l’influence de certains facteurs potentiellement important sur le système.
Comme il ra été dit au début de no PAGF s 9 Comme il l’a été dit au début de notre compte-rendu nous réalisons une chromatographie de partage sur phase inversée. Nous utilisons comme phase mobile le méthanol qul est moyennement polaire avec une phase stationnaire qui est totalement apolaire. Première analyse : Pour la première manipulation nous utilisions une phase mobile constituée à 100 % de méthanol. Nous avons ainsi fixé P-32 bar et le temps d’analyse à 4min. Le débit de méthanol pur est de 1 mC par minute.
Résultats obtenus : Formules utilisées : Facteur de capacité : Résolution: Analyse 1 Temps de rétention Facteur de capacité Pic 1 2. 182 0. 264 Pic 2 2. 254 0. 306 Pic3 2. 378 0. 378 Pic4 2. 528 0,464 1. 726 min On constate qu’en utilisant une phase mobile moyennement polaire, les résultats obtenus ne sont pas satisfaisants. Nous obtenons des pics mal séparés certains même se chevauchent il est donc impossible de cal tian entre les pics car on PAGF 6 9 phase stationnaire.
L’augmentation de la polarité change la répartition de l’analyte dans les deux phases, la quantité de matière dans la phase mobile sera plus importante ce qui augmentera le temps passé par l’analyte dans celle-ci. De plus en augmentant la polarité de la phase mobile, il y moins d’affinités entre les phases mobile et stationnaire donc plus de possibilité pour celle-ci d’interagir avec le soluté qui est bien mieux retenu d’où un temps d’élution plus long. Autre constatation les facteurs de capacité k’ sont très faibles ceci traduit un temps d’élution beaucoup trop court.
Pour une séparation optimale k’ doit être compris entre 1 et 5. Nous allons donc rajouter de l’eau dans la phase mobile pour la rendre encore plus polaire (en effet reau est un solvant très polaire) Cette première analyse chromatographique nous a quand même permis de nous faire une idée sur l’ordre d’élution des composés. En effet nos quatre composés sont des dérivés benzéniques la seule différence est la taille de la chaine carbonée greffée sur la fonction benzene. Nous savons que la polarité diminue à mesure que la chaîne alkyle augmente.
Nous pouvons donc stimer que le toluène qui présente la chaine de carbone la plus petite est le plus polaire il correspond donc à notre premier pic sur le chromatogramme, ensuite il s’agit de l’éthylbenzène, du propylbenzène et pour finir le butylbenzène qui présente la plus grande chaîne. Pour déterminer le temps mort nous avons injecté de l’acétone avant le mélange d’alkylbenzènes. Normalement c’est la première molécule de la phase mobile qui traverse l’intégralité 7 2 d’alkylbenzènes.
Normalement c’est la première molécule de la phase mobile qui traverse Pintégralité la colonne qui nous permet e déterminer le temps mort mais généralement celle-ci n’est pas détectée on utilise donc de l’acétone. Ce dernier n’a aucune affinité avec la phase stationnaire et sera donc élué tout de suite. On répètera cette injection d’acétone à chaque analyse. Seconde analyse : Nous réalisons une seconde injection pour laquelle notre phase mobile est composée de de méthanol et d’eau.
Nous gardons un débit de lml/min et nous fixons un temps d’analyse de 5 minutes. La pression est de p=52 bar. Analyse 2 2. 798 0. 528 3. 086 0. 729 Pic 3 3. 515 0. 970 Pic 4 4. 095 9 injection. Cette fois-ci nous prenons comme phase mobile un mélange méthanol-eau à 80-20%. Le débit reste le même soit 1 ml_/min comme pour les analyses précédentes et la pression Pz 57 bar. Le temps de l’analyse est fixé à 5 minutes. Tm=l . 841 3. 874 1. 104 4. 691 I . 548 6. 020 2. 270 7. 992 3. 342 Pic 1 et 2. 62 Pic 2 et 3 Pic 3 et 4 : RE591 On constate que nos pics sont plutôt bien séparés comme en atteste la résolution entre les pics mais entre les 2 premiers la résolution peut encore être améliorée. De plus le temps d’analyse est beaucoup trop long pour un mélange contenant si peu de composés. Cependant les facteurs de capacité sont relativement satisfaisants, nous avons pres ue atteint le temps d’élution optimal. PAGF 19 obtenons ne sont pas aussi satisfaisantes que nous Hespérions.
Lors d’une analyse par chromatographie l’objectif principal d’un chromatographiste est d’obtenir une résolution optimale en un minimum de temps. Cependant un des problèmes majeur de la chromatographie est que lorsqu’on l’on veut favoriser un paramètre celui-ci va impacter défavorablement une autre grandeur caractéristique. Ce problème est très bien représenté par le triangle des chromatographistes. Nous devons donc parvenir à trouver des compromis pour obtenir un domaine de chromatographie analytique qui tire profit de tous les paramètres.
Pour cela on peut jouer au niveau des réglages de l’appareillage comme par exemple une variation de température, de débit de la phase mobile ou encore la taille de la colonne. Dans notre cas nous ne pouvions pas faire varier la température car nous devions travailler à température constante. Le maintien d’une température constante permet d’assurer la répétabilité des chromatogrammes car on limite les variations locales de empérature dues aux frictions de la phase mobile sur la phase stationnaire.
Nous aurions pu faire varier la longueur de la colonne mais la durée du TP ne nous le permettait pas. En conclusion de cette partie nous pouvons estimer que les conditions optimales pour l’analyse ont été atteintes. Le seul bémol que nous pouvons faire est que l’utilisation dun débit aussi important peut saturer la colonne et est très couteux en solvant. De plus l’utilisation d’une pression aussi forte peut endommager l’appareil. 2) Influence de la taille de la chaine carbonée : Dans cette p
